Terapia Epigenómica

 

Terapia epigenómica en VIH

Tema: Control epigenético de la latencia posterior a la integración del VIH-1

Mecanismo epigenòmico tratado: Modificación de histonas, metilación de ADN 

Como se lo hizo: Se está llevando varios estudios in vitro, ex vivo e in vivo

Modificación de histonas (metilación y acetilación): Los HAT(histonas acetiltransferasas) añaden un grupo acetilo al grupo ϵ-amino de los residuos de lisina en las colas de histonas. 

Metilación de ADN: ADN proviral silenciado con la trimetilación de la histona H3 lisina en las posiciones 9 y 27 (H3K9me3, H3K27me3) o dimetilación en la lisina 9 (H3K9me2)

Resultados

• Una expresión génica activa y compite con los HDAC(histonas desacetilasas) que mitigan la transcripción al reducir la accesibilidad de las plantillas de ADN
• La condensación del nucleosoma asociado al VIH-1 (nuc1) y, por tanto, favorecen la represión de la expresión del gen del VIH
• Los resultados son alentadores y, en el futuro, la optimización del reservorio latente del VIH-1.

Referencias bibliográficas:

1.	Clinicalepigeneticsjournal.com. [cited 2024 Sep 1]. Available from: https://www.clinicalepigeneticsjournal.com/content/7/1/103

Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos

 Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos en el cáncer de mama

Tema: Impacto de la eliminación de CXCR4 Y CXCR7 mediante CRISPR/Cas9 en función de las células de cáncer de mama triple negativo.

Tipo de edición: In vitro, células TNBC

Dirigidas hacia: Eliminación del gen CXCR4 o CXCR7

Dirigidas por: CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

Uso de vectores: viral; lentivirus

Órgano/ célula a tratar: células TNBC

Vía de administración: Vía intravenosa

Resultados: La eliminación única del gen CXCR4 o CXCR7 redujo considerablemente la proliferación, el crecimiento, la migración, invasión celular y retraso de la conversión del ciclo G1/S, mientras que la eliminación conjunta inhibió las capacidades biológicas de una manera significativa. 

Referencias bibliográficas: 

1.	Yang M, Zeng C, Li P, Qian L, Ding B, Huang L, et al. Impact of CXCR4 and CXCR7 knockout by CRISPR/Cas9 on the function of triple-negative breast cancer cells. Onco Targets Ther [Internet]. 2019 [cited 2024 Aug 25];12:3849–58. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31190884/

Terapia Celular

 Terapia celular en enfermedades neurodegenerativas (PARKINSON)

Obtenido de: https://www.ruberinternacional.es/es/paciente/patologias/que-es-la-enfermedad-de-parkinson-cuales-son-sus-sintomas-d

Tipo de Stem Cell: 

Células madre mesenquimales (multipotentes).

Método de obtención: 

Se puede obtener de:

Médula ósea: Se obtiene a través de una aspiración de médula ósea, generalmente de la cresta ilíaca.

Tejido adiposo: Las CM adiposas se obtienen mediante liposucción. Este tejido es cada vez más utilizado debido a la facilidad de obtención y a la gran cantidad de células que puede proporcionar.

Líquido cefalorraquídeo: Aunque menos común, se ha explorado la posibilidad de obtener CM del líquido cefalorraquídeo. Esto permitiría una administración más directa al sistema nervioso centra

Vía de administración: 

Vía venosa periférica

Resultados

Corto plazo: Se observó una eficacia del tratamiento, lo que no se visualizaba con medicamentos y esto es gracias al reemplazo de células neuronales, presentaban mayor movilidad.

Mediano plazo: Los resultados mostraron beneficios en la capacidad de las células madre mesenquimales de reparar neuronas lesionadas y recuperar déficits neurológicos. 

Largo plazo: Se muestra que la terapia celular es una opción factible para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas puesto que encamina una neurorestauración. 

Avances con células madre mesenquimales en la enfermedad del Parkinson:

La terapia con células madre mesenquimales (MSC) en la enfermedad del Parkinson ha tenido resultados alentadores en algunos pacientes puesto que las (MSC) ayudan a reducir los síntomas de dicha enfermedad, pero se siguen haciendo aún estudios porque se observó que los pacientes en una fase temprana de la enfermedad de Parkinson tratados con células madre a menudo no experimentaban progresión de la enfermedad y presentaban una mejoría clínica más pronunciada en comparación con los pacientes tratados en fases más avanzadas de la enfermedad.

Referencias bibliográficas:

1.

Paz H, Carrasco M, Mamani R, Velarde J, Patón D, Quispe T, et al. TERAPIA CELULAR EN ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS: UNA OPCIÓN DE TRATAMIENTO INNOVADORA. Rev médica - Col Méd Paz [Internet]. 2023 [cited 2024 Aug 18];29(2):44–50. Available from: http://www.scielo.org.bo/scielo.php?pid=S1726-89582023000200044&script=sci_arttext

2. de Parkinson: E, Present PD, Therapy FOFC. Francisco Javier Sancho-Bielsa [Internet]. Elsevier.es. [citado el 18 de agosto de 2024]. Disponible en: https://multimedia.elsevier.es/PublicationsMultimediaV1/item/multimedia/S2667049621000624:mmc1.pdf?idApp=UINPBA00004N 

Ejemplo de animal transgénico

 Conejos

Es uno de los animales más utilizados porque ayuda en la producción de proteínas terapéuticas como por ejemplo la calcitonina que es utilizada para tratar la osteoporosis, también son importantes para tratar enfermedades como la fibrosis quística y la hemofilia.

Modelos animales para VIH/SIDA

Tipo de animal transgénico: Conejos transgénicos para CD4 humano 

Método de obtención: Seroconversión de los animales para la detección de genes virales mediante la reacción en cadena de la polimerasa, inoculación.

Función: Los receptores de quimiocinas como correceptores para el VIH, podría explicar los bajos niveles de infección que se obtienen en los conejos transgénicos. Se demostró que la presencia de CD4 y CCR5 humanos en células de conejo elimina el bloqueo de la entrada viral y permite la replicación a niveles similares a los que se alcanzan en células humanas

5 ventajas de los transgénicos

1. La producción de proteínas recombinantes con fines terapéuticos

2. Desarrollo de vacunas

3. Terapias génicas

4. Mejor comprensión de enfermedades en modelos de animales

5. Obtención de proteínas con modificaciones post traduccionales más complejas.

5 desventajas de los transgénicos

1. Impacto ambiental con la resistencia a antibióticos contribuyendo a la propagación de bacterias resistentes a los medicamentos

2. Aspectos éticos

3. Asegurarse que los patógenos animales no estén presentes en los preparados proteicos 

4. Afectación del sistema inmunitario y hormonal

5. Recombinación de virus y bacterias 

Referencias bibliográficas:

1.	González EE, Vázquez DM, Duarte @. Carlos A. Modelos animales para VIH/SIDA: ¿la clave para una vacuna? [Internet]. Edu.cu. [citado el 29 de julio de 2024]. Disponible en: https://elfosscientiae.cigb.edu.cu/PDFs/Biotecnol%20Apl/2001/18/2/BA001802067-075.pdf

ADN recombinante en la enfermedad provocada por flavivirus y alfavirus

 ADN Recombinante

T: Clonación de las secuencias de alfavirus y flavivirus para su uso como controles positivos en el diagnóstico molecular (1)

O: Obtener controles positivos para la validación de técnicas moleculares (RT-PCR) utilizadas en el diagnóstico de infecciones virales (1)

G: gen nsP4 481 pb / gen NS5 1385 pb / gen C / prM-M 511 pb / 5´UTR-C 275 pb (1)

ER: EcoRI (1)

ENZ: T4 ligasa (1)

V: pGEM-T Easy (1)

CR: Procariota - Escherichia coli XL1-Blue (1)

MIG: Transformación por choque térmico (1)

MIC: Cultivo, PCR (1)

Ácidos nucleicos recombinantes en la naturaleza

• Recombinación mediada por transposones y su relevancia en el estrés abiótico en plantas: Los transposones son secuencias de ADN capaces de cambiar su posición en el genoma, siendo una fuente de mutaciones y de reordenamientos cromosómicos capaces de alterar la identidad celular, regular otros genes y modificar el tamaño del genoma, entre otros. Su distribución es prácticamente propagada en los genomas eucariotas, porque pueden generar información genética nueva, movilizar genes del genoma huésped y pueden contribuir a la generación de nuevos e interesantes fenotipos, siendo evidente su importante papel en la evolución (2).  

Referencias bibliográficas: 

1.	Camacho D, Reyes J, Franco L, Comach G, Ferrer E. Clonación de secuencias de alfavirus y flavivirus para uso como controles positivos en el diagnóstico molecular. Rev Peru Med Exp Salud Publica [Internet]. 2016 [cited 2024 Jul 20];33(2):269. Available from: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46342016000200011
2.	García C. Transposones y su relevancia en el estrés abiótico en plantas [Internet]. Ull.es. [cited 2024 Jul 20]. Available from: https://riull.ull.es/xmlui/bitstream/handle/915/21706/Transposones%20y%20su%20relevancia%20en%20el%20estres%20abiotico%20en%20plantas.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Aplicación de la técnica de hibridación in situ en el Síndrome de Down

La técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) es una herramienta valiosa para el diagnóstico del síndrome de Down, tanto prenatal como postnatal, puesto que nos ayuda a proveer un diagnóstico muy rápido y seguro de las aneuploidías. Este tipo de prueba se realiza en células amnióticas en interfase, la cual tiene una interpretación que con 20 % o más de células con un patrón de signos diferentes, existe un alto riesgo de mosaicismo cromosómico.

Referencias bibliográficas:

1.

Méndez Rosado LA, Molina Gamboa O, Castelvi Lopez A, Soriano Torres M, Suarez Mayedo U, Garcia Rodríguez M, et al. Características del diagnóstico prenatal por hibridación fluorescente in situ en Cuba. Rev Cubana Pediatr [Internet]. 2020 [cited 2024 Jun 23];92(2). Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-75312020000200003

Aplicación de PCR en VIH

 

El PCR nos ayuda a detectar la presencia del virus en etapas tempranas de la infección, puesto que es altamente sensible y específica en un 95 y 98 %. Esta técnica detecta parte del genoma viral en una muestra sanguínea, permitiéndonos de esta manera diferenciar entre las dos cepas principales del VIH, VIH-1 y VIH-2. La PCR anidada es capaz de detectar de manera eficaz y rápida los genes principales del VIH-1 en pacientes pediátricos.

Imagen obtenida de: https://www.researchgate.net/figure/RT-PCR-and-sequencing-of-the-HIV-1-protease-and-RT-regions-HIV-1-RNA-was-isolated-from_fig1_5367711

Tema: Diagnóstico molecular del Virus del Papiloma Humano (VIH)

Objetivo: Determinar los principales genes de VIH mediante la técnica de RT-PCR la cual aporta información de valor diagnóstico gracias a su gran eficacia.

Tipo de muestra biológica: Se utilizó ADNg  de sangre periférica 

Tipo de ácido nucleico a ser extraído: Se utilizó ADNg extraído de un paciente considerado positivo para VIH-1 por PCR anidada.

Gen o secuencia a amplificar: ADNg extraído de la línea celular 8E5/LAV (8E5) que posee 1 genoma proviral defectivo del VIH-1 por célula. 

Tipo de PCR: PCR anidada

Sensibilidad analítica: Detección de hasta 10 cels/mm3.

Especificad analítica: 100%

Desnaturalización: Inicial 94 °C durante 5 minutos.

Visualización: . Los productos fueron evaluados a través de electroforesis en geles de agarosa al 2,5 % teñidos con bromuro de etidio (BrEt) para posteriormente ser secuenciados con el empleo de cebadores.

Referencias bibliográficas:

1. Frango A, Ramírez A, Duarte M, Alejos M, Valladares S, Eleizalde M, et al. Validación de cebadores específicos para la detección de los genes env y gag mediante reacción en cadena de la polimerasa anidada en pacientes pediátricos con infección por Virus de Inmunodeficiencia Humana-1 y su confirmación por secuenciación. Gac Med Caracas [Internet]. 2020;128(4):525–36. Available from: http://dx.doi.org/10.47307/gmc.2020.128.4.8